NEGRI AGATA

Dottorando di ricerca


Il mio progetto di dottorato ha come titolo, “Organism defense response to insecticides in arthropod vectors: from stress ecology to vector control”, ed è incentrato sullo studio dei meccanismi cellulari di detossificazione che vengono messi in atto in un dei principali vettori di malaria, Anopheles sthephensi , in seguito all’induzione con insetticida di sintesi, quale la permetrina. L’obbiettivo principale è quello di mettere a punto dei meccanismi molecolari che siano in grado di downregolare l’espressione e dunque l’attivazione di pompe ad efflusso ATP dipendenti, ABC trasportatori, in grado di espellere l’insetticida e ridurne l’attività tossica contro le zanzare. L’inibizione di queste proteine di detossificazione potrebbe infatti risultare un ottimo metodo di controllo-integrato per ridurre la popolazione di questi artropodi vettori, utilizzando dosi inferiori di insetticidi e dunque riducendo notevolmente l’inquinamento ed il danno ambientale. Per il raggiungimento di questo scopo sono stati disegnati e messi a punto degli oligonucleotidi, siRNA, in grado di downregolare l’espressione del gene ABC-G4, tramite metodica RNAi.Successivamente sono stati allestiti diversi biosaggi per valutare l’effetto di questo siRNA sulla mortalità e sull’espressione genica delle larve trattate, dopo induzione con permetrina. Le analisi molecolari effettuate tramite RT-qPCR sono state svolte su larve intere e dissezionate (intestino-carcassa). Al fine di valutare il mantenimento dell’effetto inibitorio sono stati allestiti ulteriori saggi di mortalità ed espressione anche su individui adulti. Inoltre è stata valutata la possibilità di diffusione di questi oligonucleotidi grazie all’utilizzo di siRNA-Alexa Fluor 488, marcati con fluorescente; le larve sono sate osservate al microscopio.Nell’ultimo mese è stato studiato un altro metodo d’inibizione dell’espressione: questo doveva essere più efficiente, più stabile, più economico e facilmente utilizzabile per una successiva inclusione in nanoparticelle, al fine di ottenere una più facile somministrazione alla popolazioe larvale. E’ stato dunque disegnato ed ordinato un Vivo-Morpholino AnstMO_ABCG4 che verrà impiegato nei futuri biosaggi. 

  • Ho partecipato ai seguenti seminari che rientravo nell’attività didattica ufficiale del Corso di Dottorato e non :

Lunedì 5 dicembre 2016: Prof. C. Blasi: “Progetto MAES: Mapping and Assessment of Esocystems and their Services; Prof. Carlo Ricotta: “Distanze multivariate in ecologia vegetale: cosa sono e perché si usano”Mercoledì 7 dicembre 2016: Prof. Marcello Vitale: "Aspetti metodologici per l'analisi dei dati: vecchi e nuovi approcci per la modellistica ambientale;  Prof Corrado Fanelli: “Prevenzione e controllo della presenza di micotossine in differenti alimenti.Lunedì 12 dicembre 2016: Prof. M. Nicoletti: “Evoluzione del concetto di principio attivo in sistemi complessi dinamiciMercoledi 29 marzo 2017 : Dr. Simone D’angeli : “Sicurezza nei laboratoriGiovedi 30 Marzo 2017: dott.ssa Daniela Silvia Pace .”Bioacoustics in the marine environment: a tool in ecology, behavior and conservation.Lunedi 3 aprile 2017 16.00-18.00 Dr. E. Calizza: “Polar ecology”Martedì 4 aprile 2017 : Prof. Jared Diamond.”Sociologia dell'umano e delle produzioni umane”; Prof. Robert Paine : “Villains, victims and forensis sciences: The applied used of human osteology in the legal system”; Dr. Simone Fattorini (Università degli Studi de L'Aquila): “Endemism in historical biogeography and conservation biology: concepts and implications”Durante il periodo di lavoro sperimentale svoltosi presso il laboratorio di Milano (dipartimento di Bioscienze) ho partecipato a diversi esami, come assistente-conoscitore della materia, a finco della Prof.ssa Epis (co-tutor). Inoltre ho assistito la Prof.ssa nel corso di un Tirocinio Interno di Biologia  Sperimentale, per tesisti triennali, presso lo stesso laboratorio. 

  • Per quanto riguarda le produzioni scientifiche, sono stati realizzati i seguente articoli:

 1. Mastrantonio, V., Ferrari, M., Epis, S., Negri, A., Scuccimarra, G., Montagna, M., Favia, G.,Porretta, D., Urbanelli, S., Bandi, C. (2017). Gene expression modulation of ABC transporter genes inresponse to permethrin in adults of the mosquito malaria vector Anopheles stephensi. Acta Tropica,http://dx.doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.03.012 2. Mastrantonio, V., Ferrari, M., Epis, S., Negri, A., Sturmo, T., Favia, G., Porretta D., Bandi, C., Urbanelli, S.(2017). Detoxifying action and modulated gene expression of ABC transporters during permethrinexposure in Anopheles gambiae s.s. Insect Science, in press L’articolo riguardante I risultati ottenuti dagli esperimenti degli ultimi mesi è in fase di elaborazione. 

  • Ho partecipato al congresso Italian Malaria Network (IMN) tenutosi a Roma in data 19-20 Gennaio 2017, presentando un poster con il seguente titolo ed abstract:

Temporal patterns of insecticide response in Anopheles stephensi and identification of molecular targets for gene silencing. Ferrari, M., De Marco, L., Porretta, D., Mastrantonio, V., Negri, A., Favia, G., Sassera, D., Bandi, C., Epis, S.(2017).In the past decade, national and international efforts to control and eradicate malaria allowed to reduce the number of cases and deaths worldwide. Control programs mostly rely on vector control through the use of insecticides and personal protection, employing repellents and insecticide treated bed nets. According to WHO, despite these efforts and the encouraging results achieved, 212 million cases and more than 400000 deaths still occurred in 2015. Insecticide efficacy is threatened by the insurgence of resistance mechanisms in vector mosquitoes all around the world, representing an increasing danger for people living in endemic areas. Anopheles stephensi, vector of the pathogen Plasmodium, is one of the three anopheline species responsible for malaria transmission in the south of Asia. To understand molecular and regulatory mechanisms of insecticide action, we performed a transcriptomic analysis on larvae of An. stephensi exposed for 6, 24 and 48 hours to a LD50 of permethrin, one of the most used insecticides for vector control. We created a dataset of gene families relevant in the response to toxicants such as P450, ABC-transporters, cuticular genes, glutathione S-transferase and carboxylesterases, both characterizing sequences de novo and employing already annotated sequences from the literature. ABC-transporters confirmed their major role in detoxification in insects and their potential as target for novel control strategies. Indeed, our analysis allowed us to identify ABCG4, a highly expressed ABC-transporter, as a target for the gene silencing through RNA interference (RNAi) with the goal to increase insecticide efficacy. We performed bioassays on larvae of An. stephensi exposed to a LD50 of permethrin alone and in combination with siRNAs for 6 and 24 hours. The increased mortality in siRNA treated larvae confirms the role of ABC-G4 in insecticide detoxification and the potential of RNAi for vector control.


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